D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
A Colletotrichum coccodes fitopatogén gomba veszélyes betegségeket okoz a burgonyában és a paradicsomban, amelyet antracnóznak és gumó fekete foltnak neveznek. Morfológiai jellemzői alapján gyakran nehéz megkülönböztetni őket más mikroorganizmusok által okozott betegségektől; a zöld paradicsom gyümölcsöknél a betegség tünetmentes lehet, csak érett vörös gyümölcsökön nyilvánul meg. A kórokozó gyors és pontos diagnosztizálásához valós idejű PCR-vizsgálati rendszert kínálnak. A tesztrendszer kidolgozása céljából meghatároztuk a 45 C. glicerin-trifoszfát-dehidrogenáz gén nukleotidszekvenciáját Oroszország különböző régióiban burgonyagumókból izolált törzsek.
A kapott eredmények és a GenBank adatbázisban elérhető más fajok hasonló szekvenciáinak elemzése alapján fajspecifikus primereket és próbát terveztek a C. coccodes számára. A létrehozott tesztrendszer specifikusságának ellenőrzésére PCR-t végeztünk 15 paradicsom- és burgonyanövényhez tartozó parazita és saprotrofi gomba (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes) fajának tiszta kultúrájából izolált DNS-sel. Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). A Colletotrichum coccodes DNS jelenlétét 20–27 küszöbértékű ciklusnál határozták meg, míg más fajokat 40 ciklus után, vagy nem észleltek. A vizsgálati rendszer lehetővé teszi a C. coccodes 0.01 ng / mm3 feletti DNS-koncentrációjának megbízható kimutatását az elemzett PCR-keverékben. A kifejlesztett vizsgálati rendszer felhasználásával megvizsgálták a C. coccodes jelenlétét a gombabetegség tüneteit mutató paradicsomlevelekben és a betegség külső tüneteit nem tartalmazó burgonyagumókban. A gombás fertőzés tüneteivel rendelkező leveleket a Krasznodari Terület két különböző mezejéről gyűjtöttük össze, a gumókról - a Kosztroma, Moszkva, Kaluga, Nyizsnyij Novgorod régió mezejéről. Egy C. coccodes DNS-t tartalmazó paradicsomlevelet találtak Krasznodar területén; ennek a kórokozónak a jelenlétét a Kostroma, Moszkva és Kaluga régióban termesztett gumók 5 mintájában mutatták ki.
Bevezetés
A Colletotrichum nemzetség gombái veszélyes fitopatogének, amelyek gabonaféléket, zöldségeket, gyógynövényeket, évelő gyümölcs- és bogyós növényeket érintenek. Ennek a nemzetségnek mindenütt jelen lévő faja, a Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, a burgonya és a paradicsom antracnózisának és fekete foltjának kórokozója, és számos más, a Solanaceae családba tartozó növény betegségét okozza, beleértve a növényeket is. gyomok (Dillard, 1992). A C. coccodes a növény minden földalatti részét, szárának alapját, levelét és gyümölcsét megfertőzi (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). A fertőzött burgonyagumók héján egyértelműen markáns élű szürke foltok fejlődése figyelhető meg, amelyeken jól láthatóak a sporuláció és a mikroszklerócia fekete pontjai. A tárolás során megpuhult tartalmú fekélyek képződhetnek a gumók pépében, azaz a betegség belép az antracnózis fázisába, ami azonban rendkívül ritka.
Ugyanakkor a paradicsom gyümölcsein az antracnózis (bőrfekély apró fekete pöttyökkel) tünetei jellemzőek. A leveleken a C. coccodes tünetei sötétbarna foltokként jelennek meg, amelyeket általában sárga szövet határol (Johnson, 1994).
A gumókon a fekete folt kialakulása rontja megjelenésüket, ami különösen hangsúlyos mosott vörös héjú burgonya értékesítésekor. A hámlasztás felesleges párolgáshoz és megnövekedett tárolási veszteségekhez vezet (Hunger, McIntyre, 1979). A többi növényi szerv károsodása hozamveszteséghez vezet, amelyet mind nyitott, mind zárt terepen észleltek (Johnson, 1994; Tsror és mtsai, 1999). A C. coccodes által okozott betegségek a világ szinte minden burgonyatermelő régiójában, így Oroszországban is gyakoriak (Leesa, Hilton, 2003; Belov és mtsai, 2018). Ezeknek a betegségeknek az ellenőrzése nehéz a C. coccodes elleni meglévő fungicidek elégtelen hatékonysága és a rezisztens fajták hiánya miatt (Read, Hide, 1995).
A C. coccodes inoculum megmaradhat a maggumókban (Read, Hide, 1988; Johnson és mtsai, 1997), a paradicsommagokban (Ben-Daniel és mtsai, 2010), hosszú ideig fennmarad a talajban, a növényi törmeléken (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) és a gyomokban (Raid, Pennypacker, 1987). Számos szerző művei (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson és mtsai, 1997; Dillard, Cobb, 1993) kimutatták, hogy a burgonyában és a paradicsomban a betegség kialakulása nagymértékben függ az oltóanyag jelenlététől a vetőmagban és talaj. Ezért a betegségből eredő veszteségek minimalizálása érdekében diagnosztizálni kell (a mennyiségi szempontokat is beleértve) a gomba terjedését a maganyagban, a talajban, a vetőburgonya gumókban és a tárolásra szánt paradicsommagokban. A talajban és a növényi anyagban végzett morfológiai diagnosztika csak mikroszklerotiumok jelenlétével végezhető el, amelyek azonban más típusú gombákban is megtalálhatók.
A gumók tünetei nagyon hasonlítanak a Helminthosporium solani gomba által okozott ezüst rühre. A Colletotrichum coccodes és a Helminthosporium solani izolálása tiszta tenyészetbe meglehetősen nehéz és hosszú ideig tart, mivel a tápoldaton lassan növekszik. A Colletotrichum coccodes gyors azonosításához instrumentális diagnosztikai módszereket kell alkalmazni. A legkényelmesebb módszer a polimeráz láncreakció (PCR) és annak módosítása - valós idejű PCR. Jelenleg Európában és az Egyesült Államokban brit kutatók (Cullen és mtsai, 2002) által kifejlesztett tesztrendszert alkalmaznak az rDNS ITS1 régiójához. Használata jó eredményeket mutatott az orosz izolátumok elemzésében (Belov et al, 2018). A C. coccodes azonban nagyon változó, és egyetlen DNS-szekvenciából való kimutatása hamis negatív eredményekhez vezethet. A megbízhatóbb diagnózis érdekében több fajspecifikus DNS-szekvencia elemzésére van szükség, amelynek kapcsán kifejlesztettünk egy eredeti vizsgálati rendszert, amely lehetővé teszi a C. coccodes azonosítását a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz gén szekvenciája alapján.
Anyagok és metódusok
A létrehozott tesztrendszerek hatékonyságának és specifikusságának értékeléséhez 15 gombafaj tiszta kultúráját használtuk fel, amelyet a szerzők izoláltak paradicsomlevelek és gyümölcsök, burgonyagumók beteg mintáiból (1. táblázat). Az izoláláshoz a gombás fertőzés tüneteivel rendelkező növények szerveit vettük, bokranként legfeljebb egy szervet.
Egy hámozott gumószeletet, egy szelet paradicsom gyümölcsöt és egy érintett levelet binokuláris mikroszkóp alá helyeztünk, majd ezt követően a micéliumot, a spórákat vagy egy darab szövetet Petri-csészében egy kihegyezett boncoló tűvel agar táptalajra (sör agarra) vittük. Az izolátumokat ferde agaron tároltuk kémcsövekben 4 ° C-on.
Az elemzésre szánt gombás betegségek tüneteit tartalmazó paradicsomlevelek mintáit a gyűjtés után (a terepen) azonnal 70% -os etil-alkoholba helyezték, amelyben a DNS-izolálásig tárolták őket. A burgonyagumókat a laboratóriumba szállítottuk, lehámoztuk (2 × 1 cm-es darab) belőlük, és –20 ° C-on lefagyasztottuk. A DNS-izolálásig fagyasztva tárolva.
A DNS izolálásához tiszta gombatenyészetet folyékony borsóközegben növesztettünk. A gomba micéliumát eltávolítottuk a folyékony közegből, szűrőpapíron szárítottuk, folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, homogenizáltuk, CTAB pufferben inkubáltuk, kloroformmal tisztítottuk, izopropanol és 0.5 M kálium-acetát keverékével kicsaptuk, kétszer 2% alkohollal mostuk. A kapott DNS-t ionmentesített vízben feloldjuk és –70 ° C-on tároljuk (Kutuzova et al., 20). A DNS-koncentrációt a kettős szálú DNS HS DNS-kvantifikációs készletével mértük Qubit 2017-on (Qiagen, Németország). Az alkoholizált és fagyasztott mintákat folyékony nitrogénben eldörzsöltük, majd DNS-extrakciót hajtottunk végre a fent leírtak szerint (tiszta gombatenyészetek micéliuma esetében).
1. táblázat: A felhasznált gombatörzsek eredete
Gomba neve | Növény, szerv | A kiválasztás helye |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | burgonyagumó | Kostroma régió, 1. szántóföldi generáció burgonyagumói, Red Scarlett fajta |
Colletotrichum coccodes 4 | burgonyalevél | Ismétlés. Mari El, Joshkar-Ola |
Helminthosporium solani | burgonyagumó | Magadan régió, pos. Sátor, burgonyagumó |
Cladosporium fulvum | paradicsomlevél | Moszkvai régió, nagy gyümölcsű paradicsom |
Alternaria tomatophila | paradicsom gyümölcs | az All-Russian Növényvédelmi Kutatóintézet mikológiai és fitopatológiai laboratóriumának munkatársai nyújtják be |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | paradicsom gyümölcs | Krasznodar Terület, Krymsky kerület, Krém fokozat |
Fusarium oxysporum | búzagyökér | Moszkva régió |
A PCR-t DTprime erősítőn (DNS-technológia) végeztük. A PCR-hez eredeti primereket és a glicerin-trifoszfát-dehidrogenáz gén fajspecifikus régiójának szondáját alkalmaztuk: forward primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, reverse primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). A primerek 213 bázispár méretű régiót amplifikálnak.
A reakcióhoz 50 ng teljes DNS-t (a levelek és gumók elemzése során) és 10 ng-ot (tiszta gombakultúrák DNS-jének elemzéséhez) használtunk. A reakcióelegyet (35 μl) paraffinréteggel két részre választottuk el: az alsó (20 μl) 2 μl 10 × reakciópuffert (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween-) tartalmazott. 20), 0.5 mM minden dezoxinukleotid-trifoszfátból, 7 pmol minden primerből és 4 pmol hidrolizálható fluoreszcens próbából; a felső 1 μl 10 × PCR puffert és 1 U Taq polimerázt tartalmazott.
A keverék paraffinnal történő elválasztása lehetővé teszi a csövek hosszú ideig történő tárolását 5 ° C hőmérsékleten, és meleg indítást biztosít a PCR számára, miután 10 percig 80 ° C feletti hőmérsékleten melegítették őket. A PCR-t a következő program szerint hajtottuk végre: 94.0 ° C - 90 s (1 ciklus); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 ciklus); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 ciklus); 10.0 ° C - tárolás.
Eredmények és vita
A glicerin-trifoszfát-dehidrogenáz gén szekvenciáit 45 törzsből határoztuk meg, amelyek leveleiből, száraiból, burgonyagumóiból és paradicsom gyümölcseiből lettek izolálva (Kutuzova, 2018) Oroszország különböző régióiban. Az összes törzs vizsgált szekvenciáját 2 csoportra osztottuk, amelyek két nukleotidban különböztek egymástól. Mindkét csoport képviselőinek nukleotidszekvenciáját a KY496634 és a KY496635 szám alatt a GenBank tárolja.
A coc70gdf, coc280gdr és az ezek alapján tervezett cocgdz szondákat a BLAST programmal ellenőriztük (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) a Colletotrichum nemzetségbe tartozó fajok és más, a GenBank adatbázisban elérhető szervezetek glicerin-trifoszfát-dehidrogenáz génjének minden szekvenciáján.
A primerekkel és a próbával nagyon homológ más organizmusok DNS-régióit nem találták.
A vizsgálati rendszer érzékenységét a C. coccodes DNS különböző koncentrációjú mintáival, antracnózzal fertőzött burgonyalevél DNS-jével (2017-ben gyűjtöttük Mari El-ben, Red Scarlett fajta) és a fekete folt által érintett gumók héjával (Kostroma régióban gyűjtöttük). Red Scarlett fajta, 2. táblázat). A gumókban és a burgonyalevelekben a DNS jelenlétének igazolására a C. coccodes törzseket izoláltuk belőlük tiszta tenyészetekbe.
A vizsgálati rendszer érzékenységi elemzésének eredményei azt mutatják, hogy felhasználható a C. coccodes DNS jelenlétének sikeres diagnosztizálására egy mintában, ha annak teljes tartalma a PCR-keverékben meghaladja a 0.05 ng-ot. Ez meglehetősen elegendő a kimutatáshoz, mivel egy szklerócia átlagosan 0.131 ng, egy spóra pedig körülbelül 0.04 ng DNS-t tartalmaz (Cullen és mtsai, 2002). Az angol csoport által kifejlesztett tesztrendszer (Cullen és mtsai, 2002) hasonló érzékenységet mutatott (34-es küszöbciklus 0.05 ng DNS-nél és 37 0.005 ng-nál).
A C. coccodes-t tartalmazó természetes minták elemzése minden esetben lehetővé tette annak megbízható feltárását a mintában (2. táblázat). A javasolt DNS-izolálási módszer a természetes növényi minták elemzésére is alkalmazható volt.
2. táblázat: A javasolt vizsgálati rendszer érzékenységének meghatározása a Colletotrichum coccodes azonosítására valós idejű PCR esetén
Образец | DNS-mennyiség a mintában *, ng | Küszöb ciklus | C. coccodes detektálás |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Gumó héja 1 | 50 | 32 | + |
Gumó héja 2 | 50 | 30 | + |
Gumó héja 3 | 50 | 31.5 | + |
Burgonyalevél | 50 | 29.5 | + |
Jegyzet. * PCR-termékek keverékében.
A vizsgálati rendszer specifitását 15 gombafajból kivont DNS-mintákon teszteltük. Az összes gombatörzset a szerzők izolálták az érintett és egészséges gyümölcsökből és paradicsomlevelekből, burgonyagumókból; a búzagyökérből egy törzset izoláltunk (1. táblázat). A gyümölcs felszínéről izolált fajok között vannak olyan fajok is, amelyek nem patogének a paradicsomra (például Phellinus ferrugineovelutinus).
Tanulmányok kimutatták, hogy a C. coccodes DNS-t 20–27-es küszöbcikluson detektálták, míg más gombafajokat nem észleltek, vagy a 40. ciklus után jelet adtak, ami nemspecifikus zajhatásnak tulajdonítható (3. táblázat).
3. táblázat: A vizsgálati rendszer ellenőrzése különféle gombákra vonatkozóan
Gomba neve | Küszöb ciklus |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. coccodes 2 | 22.6 |
C. coccodes 3 | 23 |
C. coccodes 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Jegyzet. * A DNS mennyisége az összes mintában 10 ng volt.
A kifejlesztett vizsgálati rendszert a C. coccodes azonosítására használták paradicsomlevelek mintáiban, nekrotróf kórokozók tüneteivel és látható burgonyagumókkal, látható tünetek nélkül. A tanulmányhoz különféle fajtájú vetőgumókat vettünk, amelyeket Kostroma, Moszkva, Kaluga, Nyizsnyij Novgorod régióban termesztettek. A C. coccodes DNS jelenlétét szignifikánsnak tekintették a mintákban, amelyek elemzésében a küszöbciklus nem haladta meg a 35-öt. Ezt a küszöbértéket 0.05 ng C. coccodes DNS megbízható meghatározása (33.5 küszöbciklus, 2. táblázat) és az a tény alapján választották meg. a 40 feletti küszöbértéknél néhány más gombafaj nemspecifikus DNS-ét diagnosztizálták. Ezzel a megközelítéssel a C. coccodes DNS jelentős jelenlétét detektálták 5 gumómintában, amelyeket Kostroma, Moszkva, Kaluga régióban növesztettek, és egy paradicsomlevélben a Krasznodar régió Yeisk kerületéből (4., 5. táblázat).
4. táblázat: Colletotrichum coccodes kimutatása burgonyagumókon *
Minta száma | Különféle burgonya | A növekedés helye | C. coccodes detektálás | Küszöb ciklus |
---|---|---|---|---|
1 | Piros Scarlet | Kostroma régió | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moszkva régió | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zsukovsky korán | Moszkva régió | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga régióban. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantázia | Kaluga régióban. | - | |
15 | ünnepi | Nyizsnyij Novgorod régióban. | - | |
16 | - |
Jegyzet. * A DNS mennyisége az összes mintában 50 ng volt.
5. táblázat: Colletotrichum coccodes kimutatása paradicsomleveleken *
Minta száma | A növekedés helye | C. coccodes detektálás | Küszöb ciklus |
---|---|---|---|
1 | Krasznodar területe, Krím körzet | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasznodar területe, Yeisk körzet | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* A DNS mennyisége az összes mintában 50 ng volt.
Az általunk létrehozott tesztrendszer érzékenységében és specifikusságában nem marad el a brit kutatók (Cullen és mtsai., 2002) által kidolgozott rendszertől, és alkalmas növényi minták elemzésére. A vetőgumók elemzésére való alkalmazása lehetővé tette a C. coccodes DNS azonosítását a gumókban külső károsodás jelei nélkül, és sikeresen elemezte a levelek fertőzését.
A mai napig nem végeztek a burgonyagumók elemzését a C. coccodes fertőzésére vonatkozóan Oroszországban. Első tanulmányunk kimutatta, hogy az Orosz Föderáció különböző régióiban termesztett 16 vizsgált vetőgumó közül 5 tartalmaz C. coccodes-t. Ez azt mutatja, hogy a burgonyagumók fekete foltja általános burgonyabetegség Oroszországban, és a burgonyatermés mennyiségének és minőségének csökkentésében betöltött szerepét alábecsülik.
A paradicsomlevelek elemzése a C. coccodes DNS jelentős jelenlétét tárta fel egy levélben Krasznodar területének Yeisk kerületéből. Korábban, amikor a dél-oroszországi paradicsomföldeket vizsgáltuk a brit tesztrendszer segítségével (Cullen et al., 2002), C. coccodes-t tartalmazó leveleket találtak, és egyes területeken a C. coccodes fertőzött levelek magas arányát találták (Belov et al. 2018). A Moszkvai régió Krasznodar és Primorsky területein paradicsomgyümölcsöket találtunk, amelyekből a C. coccodes tiszta tenyészeteit sikerült izolálnunk. Lehetséges, hogy a C. coccodes sokkal szélesebb körben elterjedt a paradicsomon Oroszországban, mint azt jelenleg gondolják, és károsságát is alábecsülik.
Így a mai napig elegendő információ gyűlt össze a C. coccodes burgonyán és paradicsomon történő elterjedéséről.
Annak érdekében, hogy jobban megértsük e gomba szerepét a burgonya és a paradicsom betegségei kialakulásában, átfogó monitorozásra van szükség annak elterjedtségében Oroszországban, tanulmányozni kell a talaj és a mag fertőzésének szerepét, valamint a fekete folt szerepét a tárolás során bekövetkező veszteségekben. A PCR diagnosztika alkalmazása jelentősen megkönnyítheti ezt a munkát, és mindkét tesztrendszer egyidejű használata jelentősen növeli az elemzés pontosságát.
Ezt a munkát az Orosz Tudományos Alapítvány 18-76-00009 számú támogatásával támogatta.
A cikk a "Mycology and Phytopathology" folyóiratban jelent meg (54. évfolyam, 1. 2020. sz.).