ESZIK. Csudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Nemrégiben bebizonyosodott, hogy az Ilyonectria crassa ascomycete gomba képes megfertőzni a burgonyagumókat. Ez a munka az első, amely a burgonyából izolált I. crassa törzs egyes fungicidjeivel szembeni biológiai jellemzőit és rezisztenciáját elemzi. A „burgonya” törzs fajspecifikus régióinak sorrendje egybeesett a nárcisz, a ginzeng, a nyár és a bükk, a liliomhagyma és a tulipánlevél gyökereiből izolált gombák esetében korábban kapott szekvenciákkal. Nyilván sok vad- és kerti növény lehet az I. crassa rezervátuma. A vizsgált törzs megfertőzte a paradicsom- és burgonyaszeleteket, de nem fertőzte meg az egész paradicsom gyümölcsöt és az ép burgonyagumót. Ez azt mutatja, hogy az I. crassa sebparazita. A fludioxonil, difenokonazol és azoxi-strobin rezisztenciájának értékelése tápanyag-tápközegben ezen gyógyszerek magas hatékonyságát mutatta.
Az EC50 indikátor (a fungicid koncentrációja, amely a telep radiális növekedési sebességének kétszeresével lelassul a fungicidmentes kontrollhoz viszonyítva) 2 volt; 0.4, illetve 7.4 mg / l. A burgonyagumók fitopatológiai értékelésénél és a növényvédelmi intézkedések kidolgozásakor figyelembe kell venni az I. crassa által okozott betegség kialakulásának lehetőségét.
A fitopatogén mikroorganizmusok fejlődése nagy veszteségekhez vezet a burgonya termesztésének és tárolásának minden szakaszában. A védintézkedések megtervezésekor általában jól ismert kórokozókat vesznek figyelembe, mint például az Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora stb. Biológiájuk kevéssé tanulmányozott, a burgonyán alkalmazott fungicidek hatékonysága velük kapcsolatban nem ismert, diagnosztikai módszereket nem fejlesztettek ki. Tömeges fejlődéssel képesek jelentős károkat okozni a burgonyatermésben. Ezen mikroorganizmusok egyike az ascomycete gomba Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, amelyet a szerzők először burgonyagumókon fedeztek fel (Chudinova et al., 2019).
Ez a munka bemutatja a burgonyagumókból izolált I. crassa törzs elemzésének eredményeit. Az I. crassa telepeinek morfológiáját és micéliumszerkezeteit, a fajspecifikus DNS régiók nukleotidszekvenciáit, a burgonyával és paradicsommal szembeni virulenciát, valamint néhány népszerű fungicidekkel szembeni rezisztenciát vizsgálták.
Anyagok és metódusok
A Kostroma régióban termesztett érintett burgonyagumóból 18-ban izolált I. crassa 2KSuPT2018 törzset használtuk. A gumót száraz rothadás érte, amelynek üregét világosbarna micélium borította. Steril boncoló tű segítségével a gomba micéliumot egy agar táptalajjal (sörlé 10%, 1.5% agar, 1000 U / ml penicillin) Petri-csészébe vittük. A lemezeket sötétben inkubáltuk 24 ° C-on.
Leica DM2500 fénymikroszkópot ICC50 HD digitális fényképezőgéppel és Leica M80 binokuláris mikroszkópot IC80HD digitális fényképezőgéppel (Leica Microsystems, Németország) használtunk a spórák és a spóraszervek fényképezéséhez, méretének és morfológiájának értékeléséhez.
A DNS izolálásához a gombás micéliumot folyékony borsóközegben növesztettük, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, homogenizáltuk, CTAB pufferben inkubáltuk, kloroformmal tisztítottuk és kétszer 2% alkohollal mostuk.
A DNS-extrakciós módszert Kutuzova és mtsai. (2017).
A faj molekuláris módszerekkel történő meghatározása és más ismert I. crassa törzsekkel való összehasonlítása céljából a PCR-t primerekkel hajtottuk végre, amelyek lehetővé tették a fajspecifikus DNS régiók amplifikációját: ITS1-5,8S-ITS2 (primerek ITS5 / ITS4, White és mtsai, 1990), b génrégiók -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) és az 1a transzlációs megnyúlási faktor (tef1α) (EF1-728F / EF1-986R primerek, Carbone és Kohn, 1999). A kívánt hosszúságú amplikonokat az Evrogen CleanUp kit segítségével kivontuk a gélből. Az amplifikált régiókat BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) alkalmazásával szekvenáltuk Applied Biosystems 3730 xl automatizált szekvenszeren (Applied Biosystems, CA, USA). A kapott nukleotidszekvenciákat egyezés keresésére használtuk fel az Egyesült Államok Nemzeti Biotechnológiai Információs Központjának (NCBI) GenBank adatbázisában. A filogenetikai elemzést a MEGA 6 programmal végeztük (Tamura et al., 2013).
A virulencia meghatározását egy nagy gyümölcsű paradicsom (Dubrava fajta) és burgonyagumók (Gala fajta) teljes zöld gyümölcsein végeztük. Ezenkívül a sérült gyümölcsök és gumók károsodásának szimulálásához ugyanazon gyümölcsökből és gumókból készült szeleteket használtuk. A gumószeleteket nedves kamrákba helyezték, amelyek Petri-csészék voltak, alul nedves szűrőpapírral. A papírra diát helyeztek, amelyre viszont gumó- vagy gyümölcsszeleteket tettek. Egész gumókat és gyümölcsöket is elhelyeztek edényekben, alul nedves szűrőpapírral. A szelet közepén (vagy a gumó vagy a gyümölcs ép felületén) egy darab agart (5 × 5 mm) gombás hifákkal helyeztünk el 5 napos sörlé agaron való növesztés után.
A gombatörzsek fungicidekkel szembeni rezisztenciájának értékelését laboratóriumi körülmények között, agar tápközegben végeztük. Vizsgáltuk a gombaölő szerekre való érzékenységet: Maxim, KS (fludioxonil hatóanyag, 25 g / l), Quadris, KS (azoxistrobin 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (Állami katalógus ..., 2020). Az értékelést Petri-csészékben, sör-agar táptalajon végeztük, a vizsgált gyógyszerek hozzáadásával 0.1 hatóanyag koncentrációban; egy; 1 ppm (mg / l) (fludioxonil és difenokonazol esetében), 10; tíz; 1 ppm (azoxistrobin esetében) és fungicid nélküli tápközegben (kontroll). A gombaölő szert megolvasztottuk és 10 ° C-ra hűtöttük, majd a táptalajt Petri-csészékbe öntöttük. A gombás micéliummal ellátott agar blokkot egy Petri-csésze közepére helyeztük, és sötétben 100 ° C hőmérsékleten tenyésztettük. 60 napos inkubálás után a telepek átmérőjét két, egymásra merőleges irányban mértük; az egyes telepek mérési eredményeit átlagoltuk. A kísérleteket három példányban hajtottuk végre. Az elemzések eredményei alapján kiszámítottuk az EC24 értéket, amely megegyezik a fungicid koncentrációjával, amely felére csökkentette a telep radiális növekedésének sebességét a fungicid kontrollhoz viszonyítva.
Eredmények és vita
A sörlé agarral ellátott petri-csészéken a gomba fehér pelyhes micéliummal rendelkező telepeket képezett. A micélium alatti tápközeg vörösesbarnává vált. Amikor a táptalaj kiszárad, a gomba kétféle spórát képezhetett egyetlen és összesített konidiofórokon kis sporodochiákban. A makrokonidiumok hosszúkásak, hengeresek, egy-három szeptummal, átlagos hosszuk 27.2 um, értéktartománya 23.2-32.2 um, szélessége - 4.9 um (1. ábra). A mikrokonídiumok átlagos hossza 14.3 µm, értéktartománya 10.3–18.1 µm, szélessége legfeljebb 4.0 µm. Minden makro- és mikromorfológiai karakter illeszkedik az Ilyonectria crassa faj variációs tartományába (Cabral et al., 2012).
A fajspecifikus DNS-régiók (ITS, b-tubulin, TEF 1α) szekvenciái teljesen egybeesnek az I. crassa törzsek általunk korábban vizsgált szekvenciáival (Chudinova et al., 2019, 1. táblázat). Az I. crassa más régiókban való előfordulásának tanulmányozása és az érintett kultúrák spektrumának elemzése érdekében a GenBank adatbázisban található hasonló DNS-szekvenciákat elemeztük (1. táblázat). Az átfedés 86-100% volt. A „burgonya” I. crassa törzs mindhárom DNS-régiójának szekvenciája azonos volt Hollandiában a liliomhagyma és a nárcisz gyökereiből, valamint a kanadai ginzenggyökérből izolált törzsek szekvenciáival. Nem találtunk más I. crassa törzseket három elemzett hasonló szekvenciával a nyílt adatbázisokban. A letétbe helyezett ITS és b-tubulin szekvenciák elemzése azonban azt mutatta, hogy az I. crassa tulipánleveleken található az Egyesült Királyságban. Hasonló ITS szekvenciájú gombákat azonosítottak a kanadai nyárgyökerek és Olaszországban a bükkgyökerek, Szaúd-Arábiában burgonyagumók mikobiotájának elemzésében (1. táblázat). E vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy az I. crassa globális elterjedésű és képes különféle növényfajok megfertőzésére.
A paradicsom- és burgonyaszeleteken a patogenitás meghatározásakor az 5. napon az elváltozás átmérője elérte az 1.5 cm-t, a vizsgált törzs nem fertőzte meg a paradicsom egész gyümölcsét és az ép burgonyagumót. A csészealjak azonban érintettek voltak a paradicsomon. A kontamináció lehetőségének kizárása érdekében a micéliumból egy burgonyagumó szeleten kifejlesztett gombás izolátumot izoláltunk tiszta tenyészetbe. Teljesen megegyezett a szülők törzsével. Nyilvánvalóan az I. crassa sebparazita.
A vetőgumók fungicidekkel történő ültetés előtti kezelése csökkenti a növények betegségeit a vegetációs időszakban. A hatékony fungicidek kiválasztásához fontos felmérni, hogy melyek hatékonyak az I. сrassa ellen. A munka a fungicidek széles körben elterjedt hatóanyagait - fludioxonil, azoxistrobin, difenokonazol - tanulmányozta. A Fludioxonil többféle keverékben van megadva, amelyet ültetés előtt magvak és gumók kezelésére használnak. A fludioxonilt (Maxim) a vetőgumók tárolás előtti kezelésére is használják. A difenokonazol és az azoxistrobin számos vetőmag-feldolgozáshoz használt készítményben, valamint a vegetatív növények feldolgozására szánt készítményekben is szerepel (State catalogue ..., 2020).
Az I. crassa növekedési sebességét táptalajon (2. ábra) vizsgáltuk különböző koncentrációjú hatóanyagokkal: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxistrobin (EC50 = 4 ppm) és difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (2. táblázat). Ezeket a készítményeket nagyon hatásosnak tekinthetjük az I. crassa ellen, mivel EC50 -jük lényegesen alacsonyabb, mint a gumók kezelésére használt munkafolyadékban a készítmény ajánlott koncentrációja. Az állami katalógus szerint ... (2020) a fludioxonil koncentrációja a burgonyagumók kezelésére szolgáló folyadékban 500-1000 ppm, azoxistrobin (a barázda aljának kezelésére szolgáló folyadékban) - 3750-9375 ppm, difenokonazol (vegetatív növények kezelésére szolgáló folyadékban) - 187.5– 625 ppm.
1. táblázat: A GenKS adatbázisban elérhető 18KSuPT2 törzs és Ilyonectria crassa törzs fajspecifikus szekvenciáinak hasonlósága
Törzs | Gazdanövény, a kiválasztás helye | A GenBankban letétbe helyezett sorszámok, a hasonlóságok százaléka | Link | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 és 18KSuPT2 | Burgonyagumó, Kostroma régió | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova és mtsai, 2019, ez a munka |
CBS 158/31 | Nárcisz gyökerek, Hollandia | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral és mtsai, 2012 |
CBS 139/30 | Lily izzó, Hollandia | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng gyökér, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulipán levél, Egyesült Királyság | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Aspen gyökerek, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield és mtsai, 2020 |
ER1937 | Bükk, Olaszország | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Közvetlen benyújtás |
KAUF19 | Burgonyagumó, Szaúd-Arábia | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = nincs lerakva
2. táblázat: Ilyonectria crassa ellenálló képessége gombaölő szerekkel szemben
(hatóanyag) | EC50, ppm | ||||
3 nap | 5 nap | 7 nap | |||
Irányítsd | 17 ± 2 | 33 ± 5 | 47 ± 3 | ||
Quadris, KS (fszoxistrobin) | 18 ± 1 | 34 ± 2 | 48 ± 2 | ||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
Maxim, KS (fludioxonil) | 16 ± 1 | 28 ± 2 | 48 ± 2 | ||
7 ± 1 | 13 ± 3 | 19 ± 4 | |||
5 ± 1 | 12 ± 1 | 17 ± 5 | |||
Skor, EC (difenokonazol) | 18 ± 1 | 35 ± 2 | 48 ± 1 | ||
11 ± 1 | 24 ± 3 | 35 ± 4 | |||
11 ± 1 | 13 ± 1 | 17 ± 3 |
Munkánk során az I. crassa törzseket izoláltuk a burgonyagumókból a Kostroma és Moszkva (Chudinova et al., 2019) régiókban. Az I. crassával megegyező, ITS-szekvenciával rendelkező gombatörzsek nagy hányada derült ki a szaúd-arábiai burgonyagumók mikobiotájának elemzésekor (Gashgari és Gherbawy, 2013). Nyilvánvalóan az I. crassa nem olyan ritka a burgonyán, mint amilyennek tűnhet. Kísérleteink azt mutatták, hogy a gomba megfertőzheti a sérült paradicsom gyümölcsöket. Az irodalomból ismert, hogy az I. crassa képes a talajban saprotrofikusan fejlődni (Moll és mtsai., 2016), valamint számos növényt érinthet, még taxonómiailag távoli növényeket is, mint például nárcisz, liliom, ginzeng, nyár és bükk (1. táblázat). egy). Nyilván sok vad- és kerti növény lehet az I. crassa rezervátuma. A fentiek azt mutatják, hogy a védelmi intézkedések kidolgozása során figyelembe kell venni a burgonyagumók e gombával történő befolyásolásának lehetőségét. A fludioxonilt, azoxistrobint és difenokonazolt tartalmazó burgonyagumók kezelésére elterjedt készítmények magas fungicid hatékonyságot mutattak az I. crassa ellen.
Ezt a munkát az Orosz Alapkutatásért Alapítvány támogatta (20-016-00139. Sz. Támogatás).
A cikk a "Plant Protection Bulletin" folyóiratban jelent meg, 2020, 103 (3)